「基因剪刀手」– CRISPR/Cas9烽火正起

台灣第二屆唐獎生技醫藥獎頒給了法國伊曼紐‧夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier）、美國珍妮佛‧道納（Jennifer A. Doudna）及美籍華裔張鋒等3位研究CRISPR/Cas9的科學家，3人9月底將來台受獎。該技術被認為是現今基因編輯最強大的工具。然百億商機何以引發3人發明專利戰火？下涉應用監管目前亦仍空白，3人同台互動將是科學界好奇的亮點。

《X戰警》(X-men)是美國漫威漫畫(Marvel Comics)旗下的系列作品描寫一群因基因突變產生超能力的變種人(Mutants)，知名角色包括能轉變成任何外型的魔形女(Mystique)、能快速自我修復的金鋼狼(Wolverine)、擁有一對翅膀的天使(Angel)等。

超能力者的題材近年來更是好萊塢片廠百試不厭的題材，且觀眾也總是十分捧場買單，但試想有一天，當人類可以操縱自己的基因時，人們是否真的能改變自身的外貌、加快身體受損時的修復速度、甚至替自己安裝上一對翅膀呢？

生物技術史進入臨床最快紀錄

一直以來，科學家持續嘗試編輯細胞中基因(DNA)的序列，不管是刪除、改變或增加DNA的片段，皆會造成細胞生產蛋白質的「質」或「量」有所改變，從根本對細胞進行改變。

1990年代，科學界發展出「鋅手指核酸酶」(Zinc Finger Nucleases, ZFNs)及「類轉錄活化因子核酸酶」(Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALENs)兩種人工改造限制酶的技術，做為編輯動植物或人類基因的工具。

然而，因ZFNs和TALENs製作過程十分不易，耗時長，加上ZFNs具有細胞毒性，TALENs則是因分子龐大不易進入細胞核中，科學家需要投入非常多資源與時間才能完成基因編輯的前置作業。

直到2012年，CRISPR/Cas9系統被廣泛研究後，基因編輯正式進入跳躍成長的時代。比起ZFNs和TALENs往往需耗費一年多，使用CRISPR/Cas9只需數周即可完成，且成功率高達80％。

在2013年被《Nature》、《Science》同時選入年度十大科學發明後，CRISPR/Cas系統之應用面自此大開。

CRISPR/Cas9也創下生物技術史上，新技術進入臨床試驗速度最快的紀錄。今年7月21日《Nature》指出，中國將於8月率先展開世界首個CRISPR/Cas9人體臨床試驗。這項人體試驗將由四川大學華西醫院教授盧鈾領導，計畫改造免疫細胞，並注射入病人體內，以治療對常規治療無反應的轉移性非小細胞肺癌。

8月31日，德國轉譯癌症研究組織(German Consortium for Translational Cancer Research, DKTK)、德國國家腫瘤疾病中心(National Center for Tumor Disease, NCT)與德勒斯登工業大學(Technische Universität Dresden)，共同發表利用CRISPR/Cas9技術成功開發腫瘤突變檢測，用以進行癌症診斷。

遺傳工程廣泛應用DNA剪輯

編輯DNA簡單地來想有3個步驟：第一，找到並鎖定(Binding)龐大DNA中欲編輯的目標片段；第二，將DNA目標片段切開(Cutting)；最後，於切開的端點加上人為修改的DNA片段後，黏合(Ligation)DNA使其回復原本的樣貌。

其實，在眾多種人類肉眼所不能見的微生物當中，就蘊含了許多能執行以上步驟的工具，這些工具被科學家統稱為限制酶(restriction enzyme)，目前已在分子生物學與遺傳工程領域有廣泛的運用。

限制酶最早被發現於某些品系的大腸桿菌(E. coli)體內，這些品系在面對噬菌體時能「限制」感染的進程，因此得其名。當細菌遭到病毒序列的入侵時，限制酶能鎖定一段特定的序列並將其切開，因此被認為是細菌所演化出對抗病毒感染的機制。

例如，一種從大腸桿菌體內發現的限制酶EcoRI，它能辨識並結合於「GAATTC」此6個核苷酸序列上，再將這段序列從「G」與「A」的中間切開。此時，這段序列被切開的小小空間就成為科學家能盡情揮灑的天地。

限制酶最早的應用之一，是將人類胰島素基因插入大腸桿菌的質體基因(plasmid)中，使之擁有製造胰島素的能力，為糖尿病患者帶來福音。

然而，植物、動物及人類的基因在數量或複雜程度皆是微生物的數倍，利用這些微生物原有的工具編輯高等生物的基因，會因為相同的切位太多，而無法將設計的序列正確地送到目標位置。

因此1990年代，科學家發明ZFNs及TALENs兩種人工改造限制酶技術。

限制酶最基本的功用就是：結合(Binding)與裁切(Cutting)。因此人工改造的限制酶至少必須由2個拼圖組合而成，一個是能結合DNA的結構域(Domain)，加上能剪切DNA的核酸酶(Nuclease)結構域。

對「鋅手指核酸酶」而言，從字面上拆解就能得知，鋅手指就是ZFNs中負責結合DNA的角色，一個鋅手指能與DNA上連續3個核苷酸(也就是一個密碼子)結合，透過基因工程客製化鋅手指的結構，就能讓科學家精確地鎖定欲編輯DNA的位置。最後接上FokI做為裁切DNA的核酸酶。(詳見圖一)

以此類推，「類轉錄活化因子核酸酶」中，是由類轉錄活化因子(Transcription activator-like effectors, TALEs)負責結合DNA的角色，但與鋅手指不同的是，一個TALE能與DNA上單一個核苷酸結合，串連多個經設計的TALE結構，可以比鋅手指更有彈性也更準確地瞄準欲編輯DNA的位置。

>>本文節錄自《環球生技月刊》2016年9月號