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CRISPR新災難 《Nature》子刊: CRISPR-Cas9可導致目標位點上錯誤的缺失與重排

2018/07/24/編輯部

 

(圖片來源:網路)

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CRISPR-Cas9有望成為臨床試驗中的基因編輯工具。而近日《Nature Biotechnology》發表了一篇關於CRISPR-Cas9誘導的雙鏈斷裂修復,會導致大量缺失和復雜重排,再次讓基因編輯技術的安全性受到質疑。研究團隊在小鼠胚胎幹細胞和人永生化細胞中利用基因編輯,觀察到的基因損傷是在所有基因座,作者還認為這樣的損傷,無法利用常用的PCR方法去檢測較大的遺傳變化。

CRISPR-Cas9系統用於人類基因治療的效用已得到認可和廣泛研究。通過開發敏感檢測方法以及改進Cas9酶和改進運送的損害,解決了編輯標靶目標活性的初步擔憂。

雖然Cas9切割後在各種細胞類型中絕大多數的標靶DNA修復結果是小於20bp的插入和缺失,但在使用Cas9或其他核酸酶的實驗中也觀察到大小數百個核苷酸的插入缺失,科學家們認為大片段插入與缺失只是實驗的個案,因此Cas9被認為具有合理的特異性,並且正在使用Cas9編輯的細胞進行首次批准的臨床試驗。

然而隨著CRISPR技術的發展,出現更多前所未有的挑戰。澳洲國立大學(Australian National University)醫學研究組長GaétanBurgio表示,「DNA斷裂發生較大的缺失已經有一段時間了,不尋常的重排率高達25%。」

Nature Biotechnology的主編Andrew Marshall同意Burgio的觀點,雖然這些發現是出乎意料的,但並不是前所未有的,他表示,之前發表於《Nature Communications》2017年的一份報告中指出CRISPR / Cas9就有導緻小鼠基因組中17個位點的複雜缺失和插入。

此次的研究是對治療相關細胞中CRISPR-Cas9編輯引起的意外事件的第一次系統評估,研究團隊將Cas9和嚮導RNA(guide RNA,gRNA)質體引入小鼠胚胎幹(ES)細胞,這些質體標靶在PigA基因的內含子和外顯子位點,這兩種細胞均導致PigA(phosphatidylinositol glycan class A)缺陷細胞。有趣的是,研究團隊針對位於內含子中的位點時,距離PigA編碼區數百個鹼基的區域中,預計突變不會引起功能問題,但它們仍能恢復缺乏PigA的細胞。

研究團對從細胞庫擴增並擴大定序目標區域的範圍,他們觀察到切割位點周圍高達千個鹼基的讀取覆蓋率的漏失,與大量缺失存在一致。為了證實這些結果,他們分離的CRISPR-Cas9處理後的單細胞,並使用PCR(long-range PCR genotyping)來表徵基因組區域,證實存在更大的缺失和重排。

另外還觀察到等位基因,其中內含子gRNA引起含有外顯子的區域的顛倒。如果評估僅限於切割部位附近,導致其表型後果被低估,那麼這些將很容易被遺漏。

Marshall博士表示,「大的刪除和重排有可能影響鄰近基因,調控元件甚至遠端基因(在重排的情況下),為基因組編輯的臨床應用增加了另一層複雜性。」

在過去的15個月中,CRISPR-Cas9基因編輯一直是一系列報告的主題,這些報告提出了關於該技術的特異性,免疫原性和致瘤性的潛在安全性問題。

包含《Nature Medicine》中的一對論文發現當CRISPR/Cas9在進行編輯時,導致的DNA損傷會誘導p53的產生,導致編輯失敗,也就是說若編輯成功的細胞,可能存在p53缺陷的細胞,因此可能會誘發癌症的發生。

研究團隊對於他們的研究成果對於CRISPR的人類基因編輯應用的未來有多重要而言並不遺憾。作者在論文中指出,廣泛的標靶基因組損傷可能具有致病後果。此外,他們指出在編輯數十億細胞的臨床環境中,產生的大量不同突變使得每個個體的一個或多個編輯細胞可能被賦予重要的致病性病變。

 

資料來源: Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

 

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